Séquençage SANGER

Horaire

Nous offrons le service de séquençage du lundi au vendredi, et les résultats sont disponibles dans les prochaines 48 heures ouvrables. Pour les projets à très haut débit, appelez-nous pour discuter d’un échéancier.

Horaire de séquençage automatique

Réception avant 16 h 15 le	Séquences remises le
Lundi	Mercredi
Mardi	Jeudi
Mercredi	Vendredi
Jeudi	Lundi
Vendredi	Mardi

* Veuillez prendre note que nous ne recevons pas d’échantillons les jours fériés; les dates de remise seront également retardées du nombre de jours de la durée des fériés.

Techniques

Quelle que soit la nature des matrices d’ADN, leur séquence est déterminée par électrophorèse capillaire grâce à une réaction de polymérisation avec la chimie des Big Dye 3.1 sur des thermocycleurs à 96 ou 384 puits. Tous les échantillons sont résolus sur une des plateformes d’Applied Biosystems, le ABI 3730xl. Cet appareil de 96 capillaires met à profit l’électrophorèse, la fluorescence et l’optique afin de résoudre simultanément la séquence de 96 échantillons sur plus de 800 nucléotides. L’appareil, entièrement robotisé, peut résoudre plus de 1 000 échantillons quotidiennement, pour un total de un million de nucléotides. Notre expérience nous a permis d’acquérir une flexibilité qui répond à la fois aux projets de quelques séquences et à ceux de plusieurs milliers, de façon à satisfaire les différents besoins des chercheurs. Nos délais de traitement sont actuellement de 48 heures.

Ouverture de compte

Afin de pouvoir soumettre des échantillons, vous devez d’abord ouvrir un compte utilisateur. Pour ce faire, communiquez par courriel avec le responsable de la plateforme, Patrick Laplante, en incluant les informations suivantes :

• Le nom de votre chercheur ou équipe;
• Un mot de passe alphanumérique de 8 caractères et commençant par une lettre;
• Le numéro de téléphone pour vous rejoindre ainsi que le poste;
• Une adresse courriel.

Si votre chercheur ou équipe n’est pas déjà inscrit, il vous faudra également ouvrir un compte pour celui-ci. Les informations suivantes seront alors requises :

• Le nom et le prénom du chercheur ou le nom de l’équipe;
• Votre département;
• Votre adresse;
• Le numéro de téléphone;
• La méthode de paiement que vous utiliserez:
  • Carte de crédit
  • Bon de commande
  • Numéro de budget CHU

Votre nom d’utilisateur vous sera par la suite envoyé par courriel.

Préparation des ADN

Plus la préparation de votre ADN sera de bonne qualité, plus les chances d’obtenir une bonne longueur de lecture seront élevées.

Si votre ADN est GC-riche, qu’il s’agit de shRNA ou encore qu’il s’agit d’ADN bisulfité, mentionnez-le-nous dans la section Instruction Spéciale du formulaire de commande (inscrire dans cette section : Échantillon GC-riche). Les structures secondaires qu’ils contiennent peuvent altérer la qualité de la séquence. Nous utilisons donc des protocoles alternatifs.

• PLASMIDE
  • Concentration: 50 ng/µL dans du Tris 10 mM pH 8,0 ou H2O
    Il est important de bien mesurer la concentration de vos ADN. Trop concentrée, la réaction de séquence pourrait chuter rapidement et diminuer grandement la longueur de lecture. Inversement, une trop faible concentration d’ADN produirait un bruit de fond élevé et induirait des erreurs dans la détermination de votre séquence.Attention lors de la resuspension de vos ADN car l’EDTA inhibe l’enzyme de séquençage en chélatant ses cofacteurs.
  • DO 260/280 : entre 1,8 et 2,0 et DO 260/230 : entre 2,0 et 2,2
    Ceux-ci sont de bons indicateurs de la pureté de votre ADN. S’il reste de l’ARN, du solvant, des sels ou des protéines dans votre échantillon, la qualité de la séquence en sera affectée.
  • Volume: 15 uL par échantillon + 10 µL/réaction
    Nous demandons un minimum de 15 µL par échantillon. Par la suite, un surplus de 10 µL par réaction de séquençage est nécessaire. Si vous ne pouvez pas nous fournir le volume demandé, nous ne pourrons faire qu’une seule réaction de séquence sans possibilité de reprise ou de vérification de dosage au Nanodrop 2000c.
  • Purification: colonnes de type commercial
    Il est recommandé d’utiliser une trousse de purification commerciale afin d’obtenir des ADN de bonne qualité. Plus vos ADN seront bien préparés, plus la séquence sera de bonne qualité. Attention aux extractions de type lyse alcaline : il reste souvent des contaminants qui inhibent la réaction de séquence. Si vous faites une purification phénol/chloroforme, prenez soin de ne pas récupérer ces solvants organiques. Peu importe le type de purification que vous utiliserez, celle-ci ne doit pas laisser de trace de solvant, ou des quantités élevées de sels, de protéines ou d’ARN qui inhiberont la réaction de séquence, c’est pourquoi nous vous conseillons fortement un deuxième lavage lors des purifications de style miniprep ainsi qu’une centrifugation à vide avant l’élution pour éliminer toute trace de contaminants sur la colonne.
• PCR
  Nous diluons vos produits PCR selon la longueur de paire de base de ceux-ci. Il est important d’être précis sur cette information afin d’obtenir la bonne concentration de départ avant la réaction de séquençage. Lorsque vous remplissez le formulaire de commande, arrondissez le nombre de paire de base au nombre supérieur près. De plus, il est important d’avoir un seul produit d’amplification par PCR, sinon il vous faudra les séparer sur gel d’agarose avant de nous faire parvenir votre échantillon. Cependant, les fragments ainsi purifiés ne donnent pas toujours de bons résultats de séquençage. Alors il serait peut-être préférable de retravailler vos conditions de PCR afin d’en arriver à un seul produit. Il est aussi possible de séquencer des amplicons de qPCR.
  • À PURIFIER
    • Purification :
      • Nous offrons sans frais supplémentaires la purification des échantillons de PCR sur membrane de fibre de verre afin d’éliminer les oligos, les dNTP et les sels.
        • Traces d’amorces PCR = double séquence.
        • Trace de dNTPs ou des sels = diminution de la longueur du CRL et de l’intensité du signal.
    • Volume : minimum 20 µL et maximum 50 µL par échantillon
      • Si vous avez 1 à 4 réactions par échantillon : un seul tube contenant minimum 20 µL et maximum 50 µL
      • Si vous avez plus de 4 réactions par échantillon :  pour chaque multiple de 4 réactions demandées, envoyer un tube contenant minimum 20 µL et maximum 50 µL
        • Exemple : si vous avez 11 réactions pour un échantillon : il sera nécessaire de nous envoyer 3 tubes contenant chacun au moins 20 µL et au plus 50 µL de cet échantillon
    • Concentration : une belle bande visible et unique sur gel
      • Une PCR de bonne efficacité vous donnera facilement ce rendement.
  • DÉJÀ PURIFIÉ
    • Volume : minimum de 20 µL par échantillon
      • Si vous avez 1 à 2 réactions par échantillon : minimum de 20 uL
      • Si vous  avez plus de 2 réactions par échantillon : ajouter 5 uL par réaction additionnelle
    • Concentration : ≥ 5 ng/µL
      • Une PCR de bonne efficacité vous donnera facilement plus de 5 ng/µL. Si vous n’arrivez pas à de tels rendements, il est possible que la réaction de séquence en soit affectée.
      • Si vous dosez au Nanodrop avant l’envoi de vos PCR : 
        • Diluez les PCR déjà purifiées à 50 ng/µL
        • Si le dosage est déjà aux alentours de 50 ng/µL ou inférieur : ne pas diluer vos échantillons.

Amorces

• Amorces spécifiques
  • Concentration : 1,6 uM ( environ 15 à 20 ng/µl)
  • Volume : 5 µL/réaction
  • Spécifications :
    Nous avons besoin d’une amorce par réaction de séquençage qui s’apparente à celles utilisées pour le PCR. Par exemple, un 18 à 24 mers avec un contenu en GC de plus de 50% est adéquat. Votre amorce doit également être spécifique à votre matrice d’ADN afin d’éviter les doubles séquences. Attention aux erreurs en 3 prime de l’amorce : elles rendent la réaction de séquence impossible. Évitez les structures secondaires dans vos amorces, le rendement de la réaction de séquence en sera affecté.
• Amorces universelles
  

  Banque d’amorces disponibles gratuitement

  Nom	Séquence	Tm (°C)
  SP6	TATTTAGGTGACACTATAG	42
  T3P	CGAAATTAACCCTCACTAAAGG	51
  T5-F	AATTTATTTGCTTTGTGAGC	47
  T5P	CCCGAAAAGTGCCACCTG	57
  T7-EEV	AAGGCTAGAGTACTTAATACGA	50
  T7p	TAATACGACTCACTATAGG	45
  T7t	GCTAGTTATTGCTCAGCGG	53
  BGH	TAGAAGGCACAGTCGAGG	54
  M13F-20	GTAAAACGACGGCCAGT	53
  M13F-47	CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC	64
  M13R-17	CAGGAAACAGCTATGAC	47
  M13R-20	GCGGATAACAATTTCACACAGG	55
  M13R-48	AGCGGATAACAATTTCACACAGGA	57
  3-AD	AGATGGTGCACGATGCACAG	58
  3-DNABD	TTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTC	49
  Ac5	ACACAAAGCCGCTCCATCAG	58
  Attr2_rev	AGGTTCCTTCACAAAGATCC	52
  5-AOX1	GACTGGTTCCAATTGACAAGC	54
  3-AOX1	GCAAATGGCATTCTGACATCC	55
  CYC1	GCGTGAATGTAAGCGTGAC	54
  CAG-F	TCGGCTTCTGGCGTGTGACC	63
  CAG-R	TGTCCCCATAATTTTTGGCAGAGG	58
  C-CMV-24	TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC	61
  CMV-Forward	CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG	64
  N-CMV-30	AATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGC	67
  DsRed1-C	AGCTGGACATCACCTCCCACAACG	63
  EXFP-R	GTCTTGTAGTTGCCGTCGTC	56
  EBVrev	GTGGTTTGTCCAAACTCATC	52
  EF1a_fwd	TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC	57
  EGFPC2_fwd	CCCAACGAGAAGCGCGATC	59
  EGFPC2_rev	CACTCAACCCTATCTCGGTC	55
  EGFP-Cfor	AGCACCCAGTCCGCCCTGAGC	67
  EGFP-Nrev	CGTCGCCGTCCAGCTC	59
  GFP-Cfor	GGTCCTTCTTGAGTTTGTAAC	51
  GFP-Fw	GAAGCAGCACGACTTCTTC	54
  GFP-reverse	GGGTAAGCTTTCCGTATGTAGC	55
  pEGFP-C	CCTGCGGAGTTCG	49
  pEGFP-C-3	TATGGCTGATTATGATCAGT	48
  pEGFP-C-5	CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG	60
  pEGFP-N-3	CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG	66
  pEGFP-N-5	TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG	53
  GLprimer2	CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA	54
  GLprimer4	GGGTAGAATGGCGCTGGG	68
  RVprimer3	CTAGCAAAATAGGCTGTCCC	53
  RVprimer4	GACGATAGTCATGCCCCGCG	61
  H1F	TGTTCTGGGAAATCACCATA	51
  HA-reverse	GCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA	63
  hEF1aprom-F	AACTGGGAAAGTGATGTCGTG	55
  hGata4-rev	ATTGTGGATGAATACTGCC	50
  hGH-pA-R	CCAGCTTGGTTCCCAATAGA	54
  hU6-F	GAGGGCCTATTTCCCATGATT	54
  IRES-F	TGGCTCTCCTCAAGCGTATT	56
  IRES-R	CCTCACATTGCCAAAAGACG	55
  Lambda-t0	GGTCATTACTGGAGTCTTG	50
  LKO1-5	GACTATCATATGCTTACCGT	50
  LucNrev	CCTTATGCAGTTGCTCTCC	47
  Luc-F	AGTCAAGTAACAACCGCGA	54
  Rluc-Rev	TCGCTGTCGTAGTAGTTGATGA	55
  MT_Forward	CATCTCAGTGCAACTAAA	47
  mCherry-F	CCCCGTAATGCAGAAGAAGA	55
  mCherry-R	TTGGTCACCTTCAGCTTGG	55
  mCherry-CTer	CCCACAACGAGGACTACA	54
  Neo-F	CGTTGGCTACCCGTGATATT	55
  Neo-R	GCCCAGTCATAGCCGAATAG	55
  pASK-fwd	GAGTTATTTTACCACTCCCT	49
  pASK-rev	CGCAGTAGCGGTAAACG	54
  pBR322ori-F	GGGAAACGCCTGGTATCTTT	55
  pCasper-hs	GCAACTACTGAAATCTGCCAAG	54
  pcDNA3-4-REV	CAACATAGTTAAGAATACCAGTC	49
  pENTR-F	CTACAAACTCTTCCTGTTAGTTAG	51
  pENTR-R	ATGGCTCATAACACCCCTTG	55
  pGEXfw	GGCAAGCCACGTTTGGTG	58
  pGEXrv	GAGCTGCATGTGTCAGAGG	56
  pGEXfw-long	GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG	66
  pGEXrv-long	CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG	64
  pGK-forward	CATTCTGCACGCTTCAAAAG	53
  pJETF	CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC	61
  pJETR	AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG	56
  pLightSwitch-F	TCCATCAAAACAAAACGAAACAA	52
  pLightSwitch-R	AGTCGAGCACGTTCATCTGCTT	59
  pMSCV	GAGACGTGCTACTTCCATTTGTC	56
  pMSCV-5'	CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC	61
  Polyhedrin	AAATGATAACCATCTCGC	47
  Poly-T	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(A/C/G)	42
  PQE-Rev	GTTCTGAGGTCATTACTGG	50
  RSV-fwd	CATGCCGATTGGTGGAAGTAAG	56
  S-tag	GAACGCCAGCACATGGACA	58
  SV40pA-R	GAAATTTGTGATGCTATTGC	48
  SV40pro-F	TATTTATGCAGAGGCCGAGG	54
  SV40rev	GGTATGGCTGATTATGATC	47
  SV40-pA-JH	AAAAAACCTCCCACACCTCC	55
  Tet-pLKO-neo-F	GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA	60
  TypeIII-IV	CGGATAACAATTTCACACAG	49
  V5_C-term	ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT	59
  WDR36exon18-F	GATGGCATCTATGACATAAGTC	51
  WDR36exon19-R	GCATTGTCAGTGCTGTCTTAC	54
  WPRE-R	CATAGCGTAAAAGGAGCAACA	53
  16S-27F	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG	54
  16S-27F(M)	AGAGTTTGATCMTGGCTCAG	54
  16S-534R	ATTACCGCGGCTGCTGG	59
  18S-NS1	GTAGTCATATGCTTGTCTC	47
  18S-NS4	CTTCCGTCAATTCCTTTAAG	49
  18S-NS8	TCCGCAGGTTCACCTACGGA	61
  ITS1	TCCGTAGGTGAACCTGCGG	60
  ITS4	TCCTCCGCTTATTGATATGC	52
  pBABE3	CCCTAACTGACACACATTCC	53

  * Si votre amorce universelle n’est pas dans cette liste, il nous fera plaisir de la faire synthétiser et de l’y ajouter.

Règles d’envoi

• Tous les échantillons doivent nous parvenir dans des microtubes de 1,5 mL (style Eppendorf), dans des tubes à PCR en « strip » ou dans des microplaques de 96 puits. Lorsque vous avez plusieurs échantillons (24 ou plus), il est plus facile pour nous de manipuler des plaques ou des strips. De plus, vous aurez moins d’identification à faire et cela réduit les erreurs de manipulations.
• Toujours écrire votre numéro de commande sur le dessus de vos tubes; il vous sera fourni sur la page de confirmation de commande.
• Inscrivez lisiblement vos noms d’échantillons et d’amorces sur le côté de vos tubes. Si les noms de vos échantillons sont très longs, vous pouvez aussi identifier vos tubes avec le numéro de puits correspondants à celui du formulaire de commande. (ex: 1, 2, 3,… ou A1-B1, C1-D1, …)
• Si vous vous servez de parafilm pour fermer vos tubes, utilisez la quantité minimale.
• Chaque tube doit avoir au minimum 10 µL.
• N’utilisez pas de ruban gommé pour identifier vos tubes, il a la fâcheuse habitude de décoller à -20 ºC.
• N’utilisez pas de ruban gommé pour lier vos échantillons ensemble, il est difficile de les séparer et efface l’encre sur les tubes. Utilisez plutôt une enveloppe, un sac d’emballage (ex: Ziploc®) ou tout autre contenant facile à manipuler.
• Il n’est pas nécessaire de mettre vos ADN sur glace ou sur glace sèche s’ils ne sont pas contaminés par des endonucléases.
• Il est recommandé de protéger vos échantillons lors du transport par courrier ou par service de messagerie : enveloppe avec du papier bulle ou dans un contenant solide comme un tube Falcon vissée de 50 mL.

Attention : assurez-vous que vos échantillons ne nous arriveront pas pendant la fin de semaine ou une journée fériée.

Adresse d’envoi

• Pour l’externe :

Patrick Laplante
Plateforme de séquençage et de génotypage (CRCHU de Québec-CHUL)
2705, boulevard Laurier, T0-72
Québec, Québec
CANADA G1V 4G2

• Pour l’interne :
  • Vos échantillons peuvent être laissés à la réception du bloc T au local TR-72 ou à l’entrée du Centre de recherche en infectiologie au local RC-709;
  • Vous pouvez venir nous les porter au local R-4756 si vous y avez accès;
  • Vous pouvez nous les envoyer par le courrier interne; comptez cependant une journée supplémentaire.