Horaire
Nous offrons le service de séquençage du lundi au vendredi, et les résultats sont disponibles dans les prochaines 48 heures ouvrables. Pour les projets à très haut débit, appelez-nous pour discuter d’un échéancier.
Horaire de séquençage automatique
| Réception avant 16 h 15 le | Séquences remises le |
|---|---|
| Lundi | Mercredi |
| Mardi | Jeudi |
| Mercredi | Vendredi |
| Jeudi | Lundi |
| Vendredi | Mardi |
Techniques
Quelle que soit la nature des matrices d’ADN, leur séquence est déterminée par électrophorèse capillaire grâce à une réaction de polymérisation avec la chimie des Big Dye 3.1 sur des thermocycleurs à 96 ou 384 puits. Tous les échantillons sont résolus sur une des plateformes d’Applied Biosystems, le ABI 3730xl. Cet appareil de 96 capillaires met à profit l’électrophorèse, la fluorescence et l’optique afin de résoudre simultanément la séquence de 96 échantillons sur plus de 800 nucléotides. L’appareil, entièrement robotisé, peut résoudre plus de 1 000 échantillons quotidiennement, pour un total de un million de nucléotides. Notre expérience nous a permis d’acquérir une flexibilité qui répond à la fois aux projets de quelques séquences et à ceux de plusieurs milliers, de façon à satisfaire les différents besoins des chercheurs. Nos délais de traitement sont actuellement de 48 heures.
Ouverture de compte
Afin de pouvoir soumettre des échantillons, vous devez d’abord ouvrir un compte utilisateur. Pour ce faire, communiquez par courriel avec le responsable de la plateforme, Patrick Laplante, en incluant les informations suivantes :
- Le nom de votre chercheur ou équipe;
- Un mot de passe alphanumérique de 8 caractères et commençant par une lettre;
- Le numéro de téléphone pour vous rejoindre ainsi que le poste;
- Une adresse courriel.
Si votre chercheur ou équipe n’est pas déjà inscrit, il vous faudra également ouvrir un compte pour celui-ci. Les informations suivantes seront alors requises :
- Le nom et le prénom du chercheur ou le nom de l’équipe;
- Votre département;
- Votre adresse;
- Le numéro de téléphone;
- La méthode de paiement que vous utiliserez:
- Carte de crédit
- Bon de commande
- Numéro de budget CHU
Votre nom d’utilisateur vous sera par la suite envoyé par courriel.
Préparation des ADN
Plus la préparation de votre ADN sera de bonne qualité, plus les chances d’obtenir une bonne longueur de lecture seront élevées.
Si votre ADN est GC-riche, qu’il s’agit de shRNA ou encore qu’il s’agit d’ADN bisulfité, mentionnez-le-nous dans la section Instruction Spéciale du formulaire de commande (inscrire dans cette section : Échantillon GC-riche). Les structures secondaires qu’ils contiennent peuvent altérer la qualité de la séquence. Nous utilisons donc des protocoles alternatifs.
- PLASMIDE
- Concentration: 50 ng/µL dans du Tris 10 mM pH 8,0 ou H2O
Il est important de bien mesurer la concentration de vos ADN. Trop concentrée, la réaction de séquence pourrait chuter rapidement et diminuer grandement la longueur de lecture. Inversement, une trop faible concentration d’ADN produirait un bruit de fond élevé et induirait des erreurs dans la détermination de votre séquence.Attention lors de la resuspension de vos ADN car l’EDTA inhibe l’enzyme de séquençage en chélatant ses cofacteurs. - DO 260/280 : entre 1,8 et 2,0 et DO 260/230 : entre 2,0 et 2,2
Ceux-ci sont de bons indicateurs de la pureté de votre ADN. S’il reste de l’ARN, du solvant, des sels ou des protéines dans votre échantillon, la qualité de la séquence en sera affectée. - Volume: 15 uL par échantillon + 10 µL/réaction
Nous demandons un minimum de 15 µL par échantillon. Par la suite, un surplus de 10 µL par réaction de séquençage est nécessaire. Si vous ne pouvez pas nous fournir le volume demandé, nous ne pourrons faire qu’une seule réaction de séquence sans possibilité de reprise ou de vérification de dosage au Nanodrop 2000c. - Purification: colonnes de type commercial
Il est recommandé d’utiliser une trousse de purification commerciale afin d’obtenir des ADN de bonne qualité. Plus vos ADN seront bien préparés, plus la séquence sera de bonne qualité. Attention aux extractions de type lyse alcaline : il reste souvent des contaminants qui inhibent la réaction de séquence. Si vous faites une purification phénol/chloroforme, prenez soin de ne pas récupérer ces solvants organiques. Peu importe le type de purification que vous utiliserez, celle-ci ne doit pas laisser de trace de solvant, ou des quantités élevées de sels, de protéines ou d’ARN qui inhiberont la réaction de séquence, c’est pourquoi nous vous conseillons fortement un deuxième lavage lors des purifications de style miniprep ainsi qu’une centrifugation à vide avant l’élution pour éliminer toute trace de contaminants sur la colonne.
- Concentration: 50 ng/µL dans du Tris 10 mM pH 8,0 ou H2O
- PCR
Nous diluons vos produits PCR selon la longueur de paire de base de ceux-ci. Il est important d’être précis sur cette information afin d’obtenir la bonne concentration de départ avant la réaction de séquençage. Lorsque vous remplissez le formulaire de commande, arrondissez le nombre de paire de base au nombre supérieur près. De plus, il est important d’avoir un seul produit d’amplification par PCR, sinon il vous faudra les séparer sur gel d’agarose avant de nous faire parvenir votre échantillon. Cependant, les fragments ainsi purifiés ne donnent pas toujours de bons résultats de séquençage. Alors il serait peut-être préférable de retravailler vos conditions de PCR afin d’en arriver à un seul produit. Il est aussi possible de séquencer des amplicons de qPCR.- À PURIFIER
- Purification :
- Nous offrons sans frais supplémentaires la purification des échantillons de PCR sur membrane de fibre de verre afin d’éliminer les oligos, les dNTP et les sels.
- Traces d’amorces PCR = double séquence.
- Trace de dNTPs ou des sels = diminution de la longueur du CRL et de l’intensité du signal.
- Nous offrons sans frais supplémentaires la purification des échantillons de PCR sur membrane de fibre de verre afin d’éliminer les oligos, les dNTP et les sels.
- Volume : minimum 20 µL et maximum 50 µL par échantillon
- Si vous avez 1 à 4 réactions par échantillon : un seul tube contenant minimum 20 µL et maximum 50 µL
- Si vous avez plus de 4 réactions par échantillon : pour chaque multiple de 4 réactions demandées, envoyer un tube contenant minimum 20 µL et maximum 50 µL
- Exemple : si vous avez 11 réactions pour un échantillon : il sera nécessaire de nous envoyer 3 tubes contenant chacun au moins 20 µL et au plus 50 µL de cet échantillon
- Concentration : une belle bande visible et unique sur gel
- Une PCR de bonne efficacité vous donnera facilement ce rendement.
- Purification :
- DÉJÀ PURIFIÉ
- Volume : minimum de 20 µL par échantillon
- Si vous avez 1 à 2 réactions par échantillon : minimum de 20 uL
- Si vous avez plus de 2 réactions par échantillon : ajouter 5 uL par réaction additionnelle
- Concentration : ≥ 5 ng/µL
- Une PCR de bonne efficacité vous donnera facilement plus de 5 ng/µL. Si vous n’arrivez pas à de tels rendements, il est possible que la réaction de séquence en soit affectée.
- Si vous dosez au Nanodrop avant l’envoi de vos PCR :
- Diluez les PCR déjà purifiées à 50 ng/µL
- Si le dosage est déjà aux alentours de 50 ng/µL ou inférieur : ne pas diluer vos échantillons.
- Volume : minimum de 20 µL par échantillon
- À PURIFIER
Amorces
- Amorces spécifiques
- Concentration : 1,6 uM ( environ 15 à 20 ng/µl)
- Volume : 5 µL/réaction
- Spécifications :
Nous avons besoin d’une amorce par réaction de séquençage qui s’apparente à celles utilisées pour le PCR. Par exemple, un 18 à 24 mers avec un contenu en GC de plus de 50% est adéquat. Votre amorce doit également être spécifique à votre matrice d’ADN afin d’éviter les doubles séquences. Attention aux erreurs en 3 prime de l’amorce : elles rendent la réaction de séquence impossible. Évitez les structures secondaires dans vos amorces, le rendement de la réaction de séquence en sera affecté.
- Amorces universelles
Banque d’amorces disponibles gratuitement
* Si votre amorce universelle n’est pas dans cette liste, il nous fera plaisir de la faire synthétiser et de l’y ajouter.Nom Séquence Tm (°C) SP6 TATTTAGGTGACACTATAG 42 T3P CGAAATTAACCCTCACTAAAGG 51 T5-F AATTTATTTGCTTTGTGAGC 47 T5P CCCGAAAAGTGCCACCTG 57 T7-EEV AAGGCTAGAGTACTTAATACGA 50 T7p TAATACGACTCACTATAGG 45 T7t GCTAGTTATTGCTCAGCGG 53 BGH TAGAAGGCACAGTCGAGG 54 M13F-20 GTAAAACGACGGCCAGT 53 M13F-47 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 64 M13R-17 CAGGAAACAGCTATGAC 47 M13R-20 GCGGATAACAATTTCACACAGG 55 M13R-48 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 57 3-AD AGATGGTGCACGATGCACAG 58 3-DNABD TTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTC 49 Ac5 ACACAAAGCCGCTCCATCAG 58 Attr2_rev AGGTTCCTTCACAAAGATCC 52 5-AOX1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC 54 3-AOX1 GCAAATGGCATTCTGACATCC 55 CYC1 GCGTGAATGTAAGCGTGAC 54 CAG-F TCGGCTTCTGGCGTGTGACC 63 CAG-R TGTCCCCATAATTTTTGGCAGAGG 58 C-CMV-24 TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC 61 CMV-Forward CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 64 N-CMV-30 AATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGC 67 DsRed1-C AGCTGGACATCACCTCCCACAACG 63 EXFP-R GTCTTGTAGTTGCCGTCGTC 56 EBVrev GTGGTTTGTCCAAACTCATC 52 EF1a_fwd TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC 57 EGFPC2_fwd CCCAACGAGAAGCGCGATC 59 EGFPC2_rev CACTCAACCCTATCTCGGTC 55 EGFP-Cfor AGCACCCAGTCCGCCCTGAGC 67 EGFP-Nrev CGTCGCCGTCCAGCTC 59 GFP-Cfor GGTCCTTCTTGAGTTTGTAAC 51 GFP-Fw GAAGCAGCACGACTTCTTC 54 GFP-reverse GGGTAAGCTTTCCGTATGTAGC 55 pEGFP-C CCTGCGGAGTTCG 49 pEGFP-C-3 TATGGCTGATTATGATCAGT 48 pEGFP-C-5 CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG 60 pEGFP-N-3 CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG 66 pEGFP-N-5 TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG 53 GLprimer2 CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA 54 GLprimer4 GGGTAGAATGGCGCTGGG 68 RVprimer3 CTAGCAAAATAGGCTGTCCC 53 RVprimer4 GACGATAGTCATGCCCCGCG 61 H1F TGTTCTGGGAAATCACCATA 51 HA-reverse GCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA 63 hEF1aprom-F AACTGGGAAAGTGATGTCGTG 55 hGata4-rev ATTGTGGATGAATACTGCC 50 hGH-pA-R CCAGCTTGGTTCCCAATAGA 54 hU6-F GAGGGCCTATTTCCCATGATT 54 IRES-F TGGCTCTCCTCAAGCGTATT 56 IRES-R CCTCACATTGCCAAAAGACG 55 Lambda-t0 GGTCATTACTGGAGTCTTG 50 LKO1-5 GACTATCATATGCTTACCGT 50 LucNrev CCTTATGCAGTTGCTCTCC 47 Luc-F AGTCAAGTAACAACCGCGA 54 Rluc-Rev TCGCTGTCGTAGTAGTTGATGA 55 MT_Forward CATCTCAGTGCAACTAAA 47 mCherry-F CCCCGTAATGCAGAAGAAGA 55 mCherry-R TTGGTCACCTTCAGCTTGG 55 mCherry-CTer CCCACAACGAGGACTACA 54 Neo-F CGTTGGCTACCCGTGATATT 55 Neo-R GCCCAGTCATAGCCGAATAG 55 pASK-fwd GAGTTATTTTACCACTCCCT 49 pASK-rev CGCAGTAGCGGTAAACG 54 pBR322ori-F GGGAAACGCCTGGTATCTTT 55 pCasper-hs GCAACTACTGAAATCTGCCAAG 54 pcDNA3-4-REV CAACATAGTTAAGAATACCAGTC 49 pENTR-F CTACAAACTCTTCCTGTTAGTTAG 51 pENTR-R ATGGCTCATAACACCCCTTG 55 pGEXfw GGCAAGCCACGTTTGGTG 58 pGEXrv GAGCTGCATGTGTCAGAGG 56 pGEXfw-long GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG 66 pGEXrv-long CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG 64 pGK-forward CATTCTGCACGCTTCAAAAG 53 pJETF CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC 61 pJETR AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG 56 pLightSwitch-F TCCATCAAAACAAAACGAAACAA 52 pLightSwitch-R AGTCGAGCACGTTCATCTGCTT 59 pMSCV GAGACGTGCTACTTCCATTTGTC 56 pMSCV-5' CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC 61 Polyhedrin AAATGATAACCATCTCGC 47 Poly-T TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(A/C/G) 42 PQE-Rev GTTCTGAGGTCATTACTGG 50 RSV-fwd CATGCCGATTGGTGGAAGTAAG 56 S-tag GAACGCCAGCACATGGACA 58 SV40pA-R GAAATTTGTGATGCTATTGC 48 SV40pro-F TATTTATGCAGAGGCCGAGG 54 SV40rev GGTATGGCTGATTATGATC 47 SV40-pA-JH AAAAAACCTCCCACACCTCC 55 Tet-pLKO-neo-F GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA 60 TypeIII-IV CGGATAACAATTTCACACAG 49 V5_C-term ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT 59 WDR36exon18-F GATGGCATCTATGACATAAGTC 51 WDR36exon19-R GCATTGTCAGTGCTGTCTTAC 54 WPRE-R CATAGCGTAAAAGGAGCAACA 53 16S-27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 54 16S-27F(M) AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 54 16S-534R ATTACCGCGGCTGCTGG 59 18S-NS1 GTAGTCATATGCTTGTCTC 47 18S-NS4 CTTCCGTCAATTCCTTTAAG 49 18S-NS8 TCCGCAGGTTCACCTACGGA 61 ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 60 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 52 pBABE3 CCCTAACTGACACACATTCC 53
Règles d’envoi
- Tous les échantillons doivent nous parvenir dans des microtubes de 1,5 mL (style Eppendorf), dans des tubes à PCR en « strip » ou dans des microplaques de 96 puits. Lorsque vous avez plusieurs échantillons (24 ou plus), il est plus facile pour nous de manipuler des plaques ou des strips. De plus, vous aurez moins d’identification à faire et cela réduit les erreurs de manipulations.
- Toujours écrire votre numéro de commande sur le dessus de vos tubes; il vous sera fourni sur la page de confirmation de commande.
- Inscrivez lisiblement vos noms d’échantillons et d’amorces sur le côté de vos tubes. Si les noms de vos échantillons sont très longs, vous pouvez aussi identifier vos tubes avec le numéro de puits correspondants à celui du formulaire de commande. (ex: 1, 2, 3,… ou A1-B1, C1-D1, …)
- Si vous vous servez de parafilm pour fermer vos tubes, utilisez la quantité minimale.
- Chaque tube doit avoir au minimum 10 µL.
- N’utilisez pas de ruban gommé pour identifier vos tubes, il a la fâcheuse habitude de décoller à -20 ºC.
- N’utilisez pas de ruban gommé pour lier vos échantillons ensemble, il est difficile de les séparer et efface l’encre sur les tubes. Utilisez plutôt une enveloppe, un sac d’emballage (ex: Ziploc®) ou tout autre contenant facile à manipuler.
- Il n’est pas nécessaire de mettre vos ADN sur glace ou sur glace sèche s’ils ne sont pas contaminés par des endonucléases.
- Il est recommandé de protéger vos échantillons lors du transport par courrier ou par service de messagerie : enveloppe avec du papier bulle ou dans un contenant solide comme un tube Falcon vissée de 50 mL.
Attention : assurez-vous que vos échantillons ne nous arriveront pas pendant la fin de semaine ou une journée fériée.
Adresse d’envoi
- Pour l’externe :Patrick Laplante,
Responsable
Plateforme de séquençage et de génotypage (CRCHU de Québec-CHUL)
2705, boulevard Laurier, T0-72
Québec, Québec
CANADA G1V 4G2 - Pour l’interne :
- Vos échantillons peuvent être laissés à la réception du bloc T au local TR-72 ou à l’entrée du Centre de recherche en infectiologie au local RC-709;
- Vous pouvez venir nous les porter au local R-4756 si vous y avez accès;
- Vous pouvez nous les envoyer par le courrier interne; comptez cependant une journée supplémentaire.