Service de séquençage Sanger

Afin de pouvoir soumettre des échantillons, vous devez d’abord ouvrir un compte utilisateur. Pour ce faire, communiquez par courriel avec le responsable de la plateforme, Patrick Laplante, en incluant les informations suivantes : 

• Le nom de votre chercheur ou équipe; 
• Un mot de passe alphanumérique de 8 caractères et commençant par une lettre; 
• Le numéro de téléphone pour vous rejoindre ainsi que le poste; 
• Une adresse courriel. 

Si votre chercheur ou équipe n’est pas déjà inscrit, il vous faudra également ouvrir un compte pour celui-ci. Les informations suivantes seront alors requises : 

• Le nom et le prénom du chercheur ou le nom de l’équipe; 
• Votre département; 
• Votre adresse; 
• Le numéro de téléphone; 
• La méthode de paiement que vous utiliserez: 
  • Carte de crédit 
  • Bon de commande 
  • Numéro de budget CHU 

Votre nom d’utilisateur vous sera par la suite envoyé par courriel.  

Voici les règles d’envoi et de préparation de vos échantillons : cliquez ici

Plus la préparation de votre ADN sera de bonne qualité, plus les chances d’obtenir une bonne longueur de lecture seront élevées.

Si votre ADN est GC-riche, qu’il s’agit de shRNA ou encore qu’il s’agît d’ADN bisulfité, mentionnez-le-nous dans la section Instruction Spéciale du formulaire de commande (inscrire dans cette section : Échantillon GC-riche). Les structures secondaires qu’ils contiennent peuvent altérer la qualité de la séquence. Nous utilisons donc des protocoles alternatifs.

Voici un lien qui vous permettra de sélectionner le protocole approprié : cliquez ici

PLASMIDE 

• Concentration : 50 ng/µl dans du Tris 10 mM pH 8,0 ou H2O
  Il est important de bien mesurer la concentration de vos ADN. Trop concentrée, la réaction de séquence pourrait chuter rapidement et diminuer grandement la longueur de lecture. Inversement, une trop faible concentration d’ADN produirait un bruit de fond élevé et induirait des erreurs dans la détermination de votre séquence. Attention lors de la resuspension de vos ADN car l’EDTA inhibe l’enzyme de séquençage en chélatant ses cofacteurs. 

• Ratio : DO 260/280 : entre 1,8 et 2,0 et DO 260/230 : entre 2,0 et 2,2
  Ceux-ci sont de bons indicateurs de la pureté de votre ADN. S’il reste de l’ARN, du solvant, des sels ou des protéines dans votre échantillon, la qualité de la séquence en sera affectée. 

• Volume : 15 µl par échantillon + 10 µl/réaction
  Nous demandons un minimum de 15 µl par échantillon. Par la suite, un surplus de 10 µl par réaction de séquençage est nécessaire. Si vous ne pouvez pas nous fournir le volume demandé, nous ne pourrons faire qu’une seule réaction de séquence sans possibilité de reprise ou de vérification de dosage au Nanodrop 2000c. 

• Purification : colonnes de type commercial
  Il est recommandé d’utiliser une trousse de purification commerciale afin d’obtenir des ADN de bonne qualité. Plus vos ADN seront bien préparés, plus la séquence sera de bonne qualité. Attention aux extractions de type lyse alcaline : il reste souvent des contaminants qui inhibent la réaction de séquence. Si vous faites une purification phénol/chloroforme, prenez soin de ne pas récupérer ces solvants organiques. Peu importe le type de purification que vous utiliserez, celle-ci ne doit pas laisser de trace de solvant, ou des quantités élevées de sels, de protéines ou d’ARN qui inhiberont la réaction de séquence, c’est pourquoi nous vous conseillons fortement un deuxième lavage lors des purifications de style miniprep ainsi qu’une centrifugation à vide avant l’élution pour éliminer toute trace de contaminants sur la colonne. 

PCR

Nous diluons vos produits PCR selon la longueur de paire de base de ceux-ci. Il est important d’être précis sur cette information afin d’obtenir la bonne concentration de départ avant la réaction de séquençage. Lorsque vous remplissez le formulaire de commande, arrondissez le nombre de paire de base au nombre supérieur près. De plus, il est important d’avoir un seul produit d’amplification par PCR, sinon il vous faudra les séparer sur gel d’agarose avant de nous faire parvenir votre échantillon. Cependant, les fragments ainsi purifiés ne donnent pas toujours de bons résultats de séquençage. Alors il serait peut-être préférable de retravailler vos conditions de PCR afin d’en arriver à un seul produit. Il est aussi possible de séquencer des amplicons de qPCR. 

À PURIFIER 

• Purification : 
  • Nous offrons sans frais supplémentaires la purification des échantillons de PCR sur membrane de fibre de verre afin d’éliminer les oligos, les dNTP et les sels. 
    • Traces d’amorces PCR = double séquence. 
    • Trace de dNTPs ou des sels = diminution de la longueur du CRL et de l’intensité du signal
• Volume : minimum 20 µl et maximum 50 µl par échantillon 
  • Si vous avez 1 à 4 réactions par échantillon : un seul tube contenant minimum 20 µl et maximum 50 µl
  • Si vous avez plus de 4 réactions par échantillon :  pour chaque multiple de 4 réactions demandées, envoyer un tube contenant minimum 20 µl et maximum 50 µl 
    • Exemple : si vous avez 11 réactions pour un échantillon : il sera nécessaire de nous envoyer 3 tubes contenant chacun au moins 20 µl et au plus 50 µl de cet échantillon 
• Concentration : une belle bande visible et unique sur gel 
  • Une PCR de bonne efficacité vous donnera facilement ce rendement. 

DÉJÀ PURIFIÉ 

• Volume : minimum de 20 µl par échantillon
  • Si vous avez 1 à 2 réactions par échantillon : minimum de 20 µl
  • Si vous avez plus de 2 réactions par échantillon : ajouter 5 µl par réaction additionnelle 

• Concentration : ≥ 5 ng/ µl
  • Une PCR de bonne efficacité vous donnera facilement plus de 5 ng/µl. Si vous n’arrivez pas à de tels rendements, il est possible que la réaction de séquence en soit affectée. 
  • Si vous dosez au Nanodrop avant l’envoi de vos PCR :  diluez les PCR déjà purifiées à 50 ng/µl 
  • Si le dosage est déjà aux alentours de 50 ng/µl ou inférieur : ne pas diluer vos échantillons. 

Amorces spécifiques 

• Concentration : 1,6 uM (environ 15 à 20 ng/µl) 
• Volume : 5 µL/réaction 
• Spécifications : Nous avons besoin d’une amorce par réaction de séquençage qui s’apparente à celles utilisées pour le PCR. Par exemple, un 18 à 24 mers avec un contenu en GC de plus de 50% est adéquat. Votre amorce doit également être spécifique à votre matrice d’ADN afin d’éviter les doubles séquences. Attention aux erreurs en 3 prime de l’amorce : elles rendent la réaction de séquence impossible. Évitez les structures secondaires dans vos amorces, le rendement de la réaction de séquence en sera affecté. 

Amorces universelles 

Si votre amorce universelle n’est pas dans cette liste, il nous fera plaisir de la faire synthétiser et de l’y ajouter.

Version PDF : Liste d’amorces universelles

Nous offrons le service de séquençage du lundi au vendredi et les résultats sont disponibles dans les prochaines 48 heures ouvrables. Pour les projets à très haut débit, appelez-nous pour discuter d’un échéancier.

• Tous les échantillons doivent nous parvenir dans des microtubes de 1,5 ml (style Eppendorf), dans des tubes à PCR en « strip » ou dans des microplaques de 96 puits. Lorsque vous avez plusieurs échantillons (24 ou plus), il est plus facile pour nous de manipuler des plaques ou des strips. De plus, vous aurez moins d’identification à faire et cela réduit les erreurs de manipulations.
• Nous recommandons à nos clients de protéger leurs échantillons dans un tube de plastique de 50 ml (une boîte de tips peut aussi convenir). Une enveloppe de papier bulle est aussi conseillée…

• Si vous utilisez des plaques 96 puits, évitez les plaques de culture cellulaire (non étanches). Les films collants pour plaques de PCR ont tendance à couler et ne sont pas recommandés pour le transport. Des capuchons de même marque que vos plaques offrent

• Toujours écrire votre numéro de commande sur le dessus de vos tubes; il vous sera fourni sur la page de confirmation de commande.
• Inscrivez lisiblement vos noms d’échantillons et d’amorces sur le côté de vos tubes. Si les noms de vos échantillons sont très longs, veuillez identifier vos tubes avec le numéro de puits correspondants à celui du formulaire de commande. (ex : 1, 2, 3, etc., ou A1-B1, C1-D1, etc.)
• Si vous vous servez de parafilm pour fermer vos tubes, utilisez la quantité minimale.
• Chaque tube doit avoir au minimum 10 µl.
• N’utilisez pas de ruban gommé pour identifier vos tubes, il a la fâcheuse habitude de décoller à -20 ºC.
• N’utilisez pas de ruban gommé pour lier vos échantillons ensemble, il est difficile de les séparer et efface l’encre sur les tubes. Utilisez plutôt une enveloppe, un sac d’emballage (ex : Ziploc®) ou tout autre contenant facile à manipuler.
• Il n’est pas nécessaire de mettre vos ADN sur glace ou sur glace sèche s’ils ne sont pas contaminés par des endonucléases.
• Il est recommandé de protéger vos échantillons lors du transport par courrier ou par service de messagerie : enveloppe avec du papier bulle ou dans un contenant solide comme un tube Falcon vissée de 50 ml.

Attention : assurez-vous que vos échantillons ne nous arriveront pas pendant la fin de semaine ou une journée fériée

Voici les deux étapes à suivre pour pouvoir créer votre commande. Chacune des étapes indiquer ci-dessous comprend les documents nécessaires pour faire la création et l’important de votre commande sur notre site Web.

• Créer votre commande sur Excel
  • Commande Excel sans BD – abrégé (PDF)
  • Commande à la verticale (PDF)
• Importer le fichier Excel sur notre site web
  • Procédure pour importer le fichier Text-Tab (PDF)

• Standard (Type de service : Séquençage)
  • Protocole de base (majorité des échantillons)

• GC-riche(Type de service : Séquençage. Écrire en instruction spéciale : GC-riche)
  • Régions contenant 50% et + de GC
  • CRISPR
  • Strech de nucléotides (C ou G)
  • Répétitions dans la séquence (ex : CAG CAG CAG CAG)
  • Short hairpins

• Bétaine (Type de service : Séquençage avec Bétaine)
• Ce protocole aide à défaire les structures secondaires et augmente l’affinité des amorces
  • Régions contenant 78-80 % et + de GC.
  • Séquences répétitives
  • Moyens hairpins

• SH (Type de service : Séquençage Bétaine Long-SH)
• Ce protocole implique de doubler/tripler le volume de réactifs (ADN, amorces, polymérase, tampon de séquençage, etc).
  • Très gros hairpins

Il n’y a pas de consensus clair pour la définition d’un échantillon GC-riche. Néanmoins, il faut tenir compte des trois paramètres suivants pour le séquençage :

• Pourcentage de résidus guanine et cytosine (50% et plus → GC-riche)
• Stretch de nucléotides (suites de C ou de G dans la séquence)
• Répétitions (par exemple, une suite de CAG) :

Si vos échantillons répondent à l’un ou l’autre de ces critères, mentionnez-le dans la section « instruction spéciale » du formulaire de commande

Pour calculer le pourcentage GC : http://www.endmemo.com/bio/gc.php

Si vous obtenez une seule bande sur gel, ne purifiez pas vos produits vous-même.

Nous offrons, sans frais supplémentaire, la purification de produits PCR sur plaque avec membrane de fibre de verre. Cette méthode de purification est de loin supérieure à n’importe quel kit commercial. Il reste fréquemment des sels ou des traces de solvants organiques dans ces préparations.

La présence de DNA loading buffer n’affecte pas la purification.

Critères de base :

• Longueur : 18-24 bases, complémentaire à votre matrice d’ADN
• Pourcentage de GC : environ 50 % (40-60%)
• Tm : 50-60°C
• Optimalement, 1-2 G/C en 5’ et en 3’ (attention ! la séquence en 3’ doit être parfaitement appariée).
• Hairpin : même sur une courte séquence, il est fréquent de voir des structures secondaires se former. Évitez les stretchs de G-C dans vos amorces.
• Dimères : en gros, si le deltaG ≤ -6.5, une proportion des amorces vont s’auto-apparier et ne seront donc pas disponibles pour la réaction de séquençage (figure a). Si l’appariement est au centre de la séquence (figure b), il faut plutôt considérer qu’un deltaG ≤ -9 est problématique.

Figure a.

Figure b.

Pour l’externe :

• Patrick Laplante
  Plateforme de séquençage et de génotypage (CRCHU de Québec-CHUL)
  2705, boulevard Laurier, T0-72
  Québec, Québec

CANADA G1V 4G2

Pour l’interne :

• Vos échantillons peuvent être laissés à la réception du bloc T au local TR-72 ou à l’entrée du Centre de recherche en infectiologie au local RC-709.
• Vous pouvez venir nous les porter au local R-4756 si vous y avez accès.
• Vous pouvez nous les envoyer par le courrier interne; comptez cependant une journée supplémentaire.