L’identification des protéines contenues dans l’échantillon biologique se fait par analyse LC-MSMS (chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem). Pour cela, les peptides issus de la digestion trypsique sont injectés sur une colonne de chromatographie liquide en phase inverse (C18) qui retient les peptides par hydrophobicité. Un gradient d’acétonitrile est ensuite appliqué afin de séparer les éluer les peptides progressivement pendant toute la durée de l’analyse (5 à 120 min).
La sortie de la colonne est directement connectée à la source électrospray du spectromètre de masse dans laquelle les peptides vont être ionisés. Le rapport masse sur charge (m/z) des ions ainsi obtenus est ensuite mesuré par les analyseurs de masse de l’instrument afin d’en obtenir un spectre dit ‘spectre MS1’. Il est également possible de fragmenter les peptides ionisés dans la cellule de collision de l’instrument afin d’obtenir des spectres de fragmentation dit ‘spectres MS2’. Le spectromètre de masse procède à à l’acquisition de milliers de spectres MS1 et de dizaines de milliers de spectres MS2 pendant la durée de l’analyse.
L’ensemble des spectres MS1 et MS2 obtenus à la fin de l’analyse sont ensuite traités par un logiciel (e.g. Mascot) afin de comparer les masses expérimentales qu’ils contiennent à des masses théoriques calculés à partir des banques de données de séquences disponibles publiquement. Le logiciel procède également au regroupement des peptides identifiés afin d’obtenir une liste de protéines ainsi qu’à la validation des résultats à 1% FDR (moins de 1% de faux-positifs).
Les résultats sont rendus sous forme de fichier Scaffold qui permet de visualiser la liste des protéines identifiées ainsi que les peptides correspondants. Il contient également des valeurs de comptage spectral (« spectral count ») qui peut donner une idée approximative de l’abondance de la protéine dans un échantillon par rapport à un autre.