Séquençage Nanopore – Nouveau service

PLASMIDE 

• Concentration : 50 ng/µl dans de l’H2O
  Il est important de bien mesurer la concentration de vos ADN. Si vous devez faire une dilution, il est recommandé de doser à nouveau l’échantillon après avoir dilué à 50 ng/µl afin d’inscrire la concentration exacte dans le formulaire d’envoi. 

• Ratio : DO 260/280 : entre 1,8 et 2,0 et DO 260/230 : entre 2,0 et 2,2
  Ceux-ci sont de bons indicateurs de la pureté de votre ADN. S’il reste de l’ARN, du solvant, des sels ou des protéines dans votre échantillon, la qualité de la séquence en sera affectée. 

• Volume : Minimum 20 µl par échantillon, si la concentration n’atteint pas 50 ng/µl, veuillez doubler le volume par échantillon.
• Attention! Les causes principales d’échec du séquençage Nanopore sont la dégradation de l’ADN et la présence d’EDTA!
  • Ne vortexez surtout pas vos plasmides
  • Utilisez des kits de purification commerciales de bonne qualité afin d’éviter les contaminants (ex. Qiagen)
  • Éluer dans l’H₂O si votre tampon d’élution contient de l’EDTA, car l’EDTA peut nuire au barcoding de vos échantillons
• Aucune amorce n’est requise pour ce type de séquençage.

PCR

Il est important d’avoir un seul produit d’amplification par PCR, sinon il vous faudra les séparer sur gel d’agarose avant de nous faire parvenir votre échantillon. Cependant, les fragments ainsi purifiés ne donnent pas toujours de bons résultats de séquençage. Alors il serait peut-être préférable de retravailler vos conditions de PCR afin d’en arriver à un seul produit.

À PURIFIER 

• Purification : 
  • Nous offrons sans frais supplémentaires la purification des échantillons de PCR sur membrane de fibre de verre afin d’éliminer les oligos, les dNTP et les sels. 
• Volume : minimum 20 µl et maximum 50 µl par échantillon 
• Concentration : une belle bande visible et unique sur gel 
  • Une PCR de bonne efficacité vous donnera facilement ce rendement. 

DÉJÀ PURIFIÉ 

• Volume : minimum de 25 µl par échantillon

• Concentration : ≥ 5 ng/ µl
  • Une PCR de bonne efficacité vous donnera facilement plus de 5 ng/µl. Si vous n’arrivez pas à de tels rendements, il est possible que la réaction de séquence en soit affectée. 
  • Si vous dosez au Nanodrop avant l’envoi de vos PCR :  diluez les PCR déjà purifiées à 50 ng/µl 
  • Si le dosage est déjà aux alentours de 50 ng/µl ou inférieur : ne pas diluer vos échantillons. 

La création de commande se fait par courriel pour l’instant.

Communiquez avec nous par courriel (sequences@crchudequebec.ulaval.ca) pour nous faire part de votre demande de service de séquençage Nanopore. Nous vous enverrons la procédure à suivre et les documents nécessaires pour compléter la demande de service.

Merci d’envoyer le fichier Excel complété. Chaque information est importante. Un fichier complet facilite grandement le traitement de vos échantillons.

Voici les informations requises :

• Nom, Équipe, Budget
• Nom de l’échantillon
• Concentration au NanoDrop (il est recommandé de re-doser les échantillons après les avoir dilués à 50 ng/ul afin d’avoir la concentration exacte)
• Volume fourni, Ratios 260/230 et 260/280, Tampon d’élution
• Taille (pb) et vecteur (si vous avez plusieurs variations du même plasmide et voulez donc comparez à la même séquence de référence)
• Si vous avez la concentration au Qubit, vous pouvez l’ajouter dans une colonne supplémentaire. Ceci facilite grandement le traitement de vos échantillons.

***Et SVP envoyez la séquence de référence en FASTA (.fa) ou fichier SnapGene (.dna)***

L’analyse est effectuée avec le workflow wf-clone validation du logiciel Epi2Me. Les résultats incluent :

• Un rapport d’assemblage (wf-clone-validation-report.html)
• Une séquence consensus (FASTA)
• Une carte annotée produite par pLannotate (.gbk)
• Et plus encore…

Le séquençage de plasmide entier Nanopore coûte 20$ par échantillon.

Le séquençage Nanopore est offert une fois toutes les 1 à 2 semaines, selon le nombre d’échantillons reçus. Afin d’être inclus dans le séquençage du jour X, les échantillons doivent être reçus au plus tard 2 jours plus tôt, en fin de journée (16h15). Les résultats devraient être disponibles le lendemain du séquençage, après un contrôle qualité des résultats. Ceux-ci comprennent, entre autres, une carte du plasmide, la séquence FASTA et un rapport de séquençage.

Pour planifier l’envoi de vos échantillons :

• Écrivez-nous à sequences@crchudequebec.ulaval.ca
• Consultez le calendrier Outlook des prochains séquençages Nanopore (sujet à changement selon le nombre d’échantillons reçus)

• Toujours écrire sur vos tubes le nom de l’échantillon, votre nom et la mention « Nanopore » ou « ONT » afin de les différencier des échantillons destinés au séquençage Sanger.
• Méthodes de purification compatibles avec le séquençage nanopore : les billes magnétiques ou les colonnes de centrifugation commerciales de bonne qualité.
• Nous vous conseillons fortement un deuxième lavage lors des purifications de style miniprep ainsi qu’une centrifugation à vide avant l’élution pour éliminer toute trace de contaminants sur la colonne. 
• L’utilisation de phénol-chloroforme affecte négativement les cellules à flux (flow cells) de séquençage Nanopore en endommageant les composants physiques et en inhibant le processus de séquençage. Ne PAS nous envoyer des échantillons purifiés par cette méthode.
• Tous les échantillons doivent nous parvenir dans des microtubes de 1,5 ml (style Eppendorf). Lorsque vous avez plusieurs échantillons (24 ou plus), il est plus facile pour nous de manipuler des plaques ou des strips. De plus, vous aurez moins d’identification à faire et cela réduit les erreurs de manipulation.
• Nous recommandons à nos clients de protéger leurs échantillons dans un tube de plastique de 50 ml (une boîte de tips peut aussi convenir). Une enveloppe de papier bulle est aussi conseillée.

• Si vous utilisez des plaques 96 puits, évitez les plaques de culture cellulaire (non étanches). Les films collants pour plaques de PCR ont tendance à couler et ne sont pas recommandés pour le transport. Des capuchons de même marque que vos plaques offrent une solution simple et efficace à ce problème.

• Si vous vous servez de parafilm pour fermer vos tubes, utilisez la quantité minimale.
• N’utilisez pas de ruban gommé pour identifier vos tubes, il a la fâcheuse habitude de décoller à -20 ºC.
• N’utilisez pas de ruban gommé pour lier vos échantillons ensemble, il est difficile de les séparer et cela efface l’encre sur les tubes. Utilisez plutôt une enveloppe, un sac d’emballage (ex : Ziploc®) ou tout autre contenant facile à manipuler.
• Il n’est pas nécessaire de mettre vos ADN sur glace ou sur glace sèche s’ils ne sont pas contaminés par des endonucléases.
• Il est recommandé de protéger vos échantillons lors du transport par courrier ou par service de messagerie : enveloppe avec du papier bulle ou dans un contenant solide comme un tube Falcon vissé de 50 ml.

Attention : assurez-vous que vos échantillons ne nous arriveront pas pendant la fin de semaine ou une journée fériée.

Pour l’externe :

• Patrick Laplante
  Plateforme de séquençage et de génotypage (CRCHU de Québec-CHUL)
  2705, boulevard Laurier, T0-72
  Québec, Québec

CANADA G1V 4G2

Pour l’interne :

• Vos échantillons peuvent être laissés à la réception du bloc T au local TR-72 ou à l’entrée du Centre de recherche en infectiologie au local RC-709.
• Vous pouvez venir nous les porter au local R-4756 si vous y avez accès.
• Vous pouvez nous les envoyer par le courrier interne; comptez cependant une journée supplémentaire.

Pour plus d’informations concernant le séquençage Nanopore ou pour planifier l’envoi d’échantillons, n’hésitez-pas à contacter directement Léa Lambert (lea.lambert@crchudequebec.ulaval.ca).

Pour en savoir plus sur la technologie utilisée pour le séquençage Nanopore, le vidéo suivant illustre bien le fonctionnement du séquençage Nanopore : https://www.youtube.com/watch?v=RcP85JHLmnI.