Protocoles

Coloration au bleu de Coomassie

Plonger le gel dans 0.5% bleu de Coomassie G-250 préparé dans 50% méthanol, 10% acide acétique pendant 5 minutes.
Jeter le colorant et rincer brièvement à l’eau MilliQ pour éliminer les traces de colorant dans le contenant.
Décolorer avec 40% méthanol et 10% acide acétique en remplaçant la solution toutes les 10-20 minutes jusqu’à ce que des bandes soient observables. Des Kimwipes roulées en boules et ajoutées à la solution peuvent accélérer la décoloration.
Continuer la décoloration avec de l’eau MilliQ jusqu’à ce que les bandes soient nettement visibles. Habituellement, nous laissons la décoloration se poursuivre pendant une nuit avec plusieurs Kimwipes. Les bandes ou points peuvent ensuite être découpés et être soumis pour analyse.

Plonger le gel dans 50% méthanol et 7% acide acétique pendant 30-60 minutes.
Colorer le gel dans le SYPRO Ruby non dilué pendant 3 heures (ou pendant une nuit).
Décolorer le gel dans 50% méthanol pendant 1 minute.
Décolorer le gel dans 10% méthanol et 7% acide acétique pendant 30-60 minutes.
Rincer à l’eau pendant 5 minutes deux fois.

(Pour le protocol original, voir Electrophoresis 1997;18(3-4):349-59. Pour des conseils généraux sur la coloration au nitrate d’argent, voir Nat Protoc. 2006;1(4):1852-1858.)

Étape de fixation: Tremper le gel dans un bain de 30% EtOH et 10% acide acétique pour 30 minutes 3 fois. Rincer dans une solution de 20% EtOH pendant 10 minutes, puis dans l’eau pendant 10 minutes.
Étape de sensibilisation: Tremper le gel dans un bain de sodium thiosulfate (2.0g/l) pendant 1 minute. Rincer à l’eau pendant 20 secondes 2 fois.
Étape de traitement au nitrate d’argent: Traiter au nitrate d’argent (2.0g/l) pour 30 minutes. Rincer à l’eau pendant 5-10 secondes.
Étape de développement: Tremper dans un bain de 37% formaldehyde (0.7ml/l), potassium carbonate (anhyd., 30g/l) et sodium thiosulfate (10mg/l) pendant 3 minutes 2 fois (ou jusqu’à l’intensité désirée).
Neutralisation du développement: Tremper dans un bain de Tris (50g/l) et 2.5% acide acétique pendant 1 minute.
Conservation: Conserver dans l’eau.

(Pour le protocol original, voir Anal Chem. 1996;68(5):850-8. Pour des conseils généraux sur la coloration au nitrate d’argent, voir Nat Protoc. 2006;1(4):1852-1858.)

Étape de fixation: Plonger le gel dans un bain de 50% MeOH, 12% acide acétique (240ml/2l), 0.05% formaldéhyde (2.7ml/2l) pendant 2 heures (ou pendant une nuit). Rinser dans un bain de 35% EtOH (700ml/2l) pendant 20 minutes 3 fois.
Étape de sensibilistaion: Plonger le gel dans un bain de 0.02% sodium thiosulfate (2ml de 20%/2l) pendant 2 minutes. Rincer à l’eau pendant 5 minutes 3 fois.
Étape de traitement au nitrate d’argent: Plonger le gel dans un bain de 0.2% AgNO3 (4g/2l) et 0.076% formaldéhyde (4.1ml/2l) pendant 20 minutes. Rincer à l’eau pendant 1 minute 2 fois.
Étape de développement: Plonger le gel dans un bain de 6% sodium carbonate (120g/2l), 0.5% formaldéhyde (2.7ml/2l) et 0.0004% sodium thiosulfate (40μl/2l) pour 2-15 minutes.
Neutralisation du développement: Plonger dans un bain de 50% MeOH et 12% acide acétique pendant 5 minutes.
Conservation: Conserver dans une solution 1% acide acétique (20ml/2l) à 4°C.