Veuillez suivre les procédures ci-dessous pour soumettre vos échantillons pour fin d’analyse.
Instructions générales
Pour toute soumission d’échantillon, veuillez compléter le formulaire échantillon correspondant au type d’analyse que vous désirez. Si vous faites affaire avec nous pour la première fois, ou si vos coordonnées ont changé, veuillez aussi compléter le formulaire chercheur. Vous pouvez nous faire parvenir les formulaires par courrier électronique à proteomique@crchul.ulaval.ca.
Si vous devez nous envoyer vos échantillons par la poste, utiliser un service de courrier rapide (par exemple: FedEx ou Purolator) et envoyez vos échantillons en début de semaine pour éviter qu’ils ne passent une fin de semaine à température ambiante durant le transport. Utilisez l’adresse de nos informations de contact. Par exemple:
À l’attention de Sylvie Bourassa
Plateforme de Protéomique
R2-2710
2705 boul. Laurier
Ville de Québec, Qc, G1V 4G2
Pour les chercheurs du CHU de Québec, les paiements peuvent être effectués par transfert de compte. Les bons de commande et les cartes de crédit sont aussi acceptés.
Identification de protéines par spectrométrie de masse (LC/MS/MS)
Échantillons provenant de gel d’acrylamide:
- Assurez-vous de porter des gants en tout temps de façon à éviter la contamination de vos échantillons par les kératines. Éviter la poussière et utiliser de la vaisselle propre lors de la préparation de vos échantillons.
- Colorez votre gel au bleu de coomassie ou au sypro ruby. Il est PRIMORDIAL d’effectuer les étapes de décoloration (destain) décrite dans les protocoles pour éliminer le SDS résiduel. Si vouz n’avez pas le choix d’utiliser le nitrate d’argent, lisez ce commentaire et contactez-nous.
- Coupez chaque bande de gel au scalpel en prenant soin d’éliminer tout le gel superflu et les transférer dans des eppendorfs avec 100 ul eau bidistillée.
- Afin que les eppendorfs ne soient pas écrasés durant le transport, vous pouvez les mettre dans un tube falcon ou dans une autre boîte.
Échantillons pour digestion en solution:
- Idéalement, nous préférons recevoir les échantillons pour la digestion en solution dans une solution volatile comme formic 0.1%, Acetonitrile, ammonium bicarbonate, sans détersif ni autre sel, et évaporé à sec. Veuillez nous contacter avant de soumettre votre échantillon.
Pour la coloration au nitrate d’argent:
- Veuillez vous assurer d’utiliser un protocole compatible avec la spectrométrie de masse (sans glutaraldéhyde). Si vous n’avez pas de protocole, vous pouvez utiliser un des deux protocoles fournis dans la section Documents de notre site web.
- Lorsque c’est possible, il est toujours préférable d’utiliser la coloration au sypro ruby ou au bleu de coomassie plutôt que le nitrate d’argent. Notre expérience démontre que pour 100 fmol de BSA déposé sur un gel, plus de peptides seront analysés en spectrométrie de masse pour le gel coloré au sypro ruby ou au coomassie que pour le gel coloré au nitrate d’argent. Il semble que la coloration au nitrate d’argent elle-même ou les étapes supplémentaires requises pour la décoloration du gel diminuent le rendement de la digestion.
Identification de sites de modifications post-traductionnelles
Nous analysons des sites de modification post-traductionnelles sur une base régulière, entre autres les phosphorylations. Notre taux de succès est très bon pour les protéines enrichies ou partiellement purifiées.
Si vous voulez nous soumettre des échantillons pour ce genre d’analyse, une plus grande quantité de protéines à analyser est préférable (par exemple, une bande d’intensité moyenne à élevée en bleu de coomassie).
Nous avons besoin de la séquence en format électronique de la protéine potentiellement modifiée, car nous faisons la recherche directement dans cette séquence pour les sites de modification.
De plus, si des sites potentiels sont connus, nous pouvons augmenter les chances de succès en ciblant ces sites de façon particulière dans le spectromètre de masse. Par exemple, il se peut que le peptide phosphorylé soit présent mais en trop faible quantité pour être detecté et fragmenté. En ciblant le site en question, le peptide correspondant sera fragmenté de façon préférentielle s’il est présent. Nous pouvons cibler environ 5 à 10 sites par protéine.
Quantification relative par marquage isotopique (iTRAQ)
Les chercheurs intéressés à soumettre des échantillons pour une analyse quantitative iTRAQ sont d’abord priés de contacter le personnel de la plate-forme.
Pour ce type d’analyse le chercheur devra soumettre de 100 à 200 µg de protéines pour chaque condition étudiée. Lorsque la quantité de protéine disponible est plus faible, par exemple dans les cas d’immunoprécipitation, veuillez nous contacter.
Lorsque nous recevons les échantillons, les protéines sont généralement précipitées à l’acétone afin de concentrer les protéines et d’éliminer la plupart des tampons et détergents qui ont servi à l’extraction. Les protéines sont ensuite resolubilisées dans le tampon de marquage iTRAQ. La quantité de protéines dans les échantillons est alors déterminée par la méthode de Bradford sur un lecteur de plaque, puis une quantité identique de protéines pour chaque échantillon sera marquée par les réactifs iTRAQ. Le marquage iTRAQ requiert que les protéines soient présentes dans un solvant ne contenant ni amine primaire (Tris, bicarbonate d’ammonium, etc.) ni détergent. (Voir plus bas pour une liste de composés à éviter ou à proscrire et pour une liste de produits recommandés.)
Note importante:
- Toute analyse protéomique est confrontée à l’immense plage dynamique des concentrations des protéines dans un extrait cellulaire. Contrairement aux molécules d’acides nucléiques qui peuvent être amplifiées, les protéines détectées par le spectromètre de masse dans un extrait le sont en fonction de leur concentration initiale dans l’extrait. Dans ce contexte, les protéines les plus abondantes monopoliseront le détecteur du spectromètre de masse au détriment des protéines peu abondantes. Il est donc important de garder en tête que plus un extrait cellulaire est fractionné, meilleures seront les chances d’identifier des protéines régulatrices de faible abondance. À l’inverse, un extrait brut risque de fournir des identifications de protéines provenant surtout du cytosquelette ou impliquées dans le métabolisme intermédiaire.
Composés à éviter ou à proscrire dans le tampon de lyse utilisé pour extraire et solubiliser les protéines
Produits recommandés:
Quantification relative ou absolue par MRM
Veuillez nous contacter!