Génotypage SEQUENOM

Horaire

Les services de génotypage de SNP sont offerts du lundi au vendredi. Les résultats sont disponibles en format électronique.

Le temps d’analyse nécessaire du début jusqu’à la fin pour produire les résultats est variable. Le temps réel de laboratoire est d’environ deux jours dû aux longues étapes de PCR. Quelques jours additionnels sont nécessaires pour la mise au point des amorces, leur achat et l’analyse des résultats.

Appelez-nous pour discuter de l’ouverture d’un projet, de la mise au point des amorces, des coûts finaux et des délais à prévoir.

Vous pouvez également nous joindre si vous êtes intéressé à faire de la découverte de SNP par spectrométrie de masse grâce à la technologie MassARRAY Discovery.

Avantages

Quelques-uns des nombreux avantages à utiliser cette technique.

  • Exactitude: données de haute qualité basées sur la détection de masse spécifique.
  • Optimisation: une chimie robuste et simple qui donne de bons résultats et qui requiert peu de mise au point.
  • Conception d’analyse: le logiciel de conception d’amorces favorise une conception d’essais multiplexes optimale en rejetant les essais formant des structures d’épingle ou des dimères d’amorces.
  • Le logiciel d’acquisition de données RT attribue les génotypes en temps réel, éliminant ainsi une étape très longue lorsque plusieurs milliers d’échantillons sont analysés.
  • Le logiciel d’analyse Typer est complet, avec une orientation scientifique donnant des résultats dans plusieurs variétés de graphiques, incluant des valeurs de chi-carré, de Hardy-Weinberg et de p-value.
  • Résultats: remis électroniquement sous forme de chiffrier Excel ou sur cédérom.
  • Reproductibilité: les expériences peuvent facilement être dupliquées.
  • Production: haut taux de conversion de SNP en génotype.
  • Multiplexe élevé: jusqu’à 36 SNP peuvent être faits sur un même échantillon d’ADN.

Techniques

La méthode de génotypage par MassARRAY SNP Multiplex est idéale pour interroger de 24 à 36 SNP sur une centaine ou plusieurs milliers d’échantillons. Le processus débute avec une liste de SNP que nous soumettons au logiciel de conception d’essais. Des amplicons entre 80 et 120 nt seront ciblés et une liste d’amorces pour la réaction PCR et la réaction d’extension iPLEX sera produite selon des règles sévères. Une fois les concentrations stock établies et les amorces définies, ces dernières pourront être synthétisées. Les concentrations des amorces iPLEX sont ajustées afin qu’elles puissent toutes être résolues sur le spectre MALDI-TOF.

Étapes de la réaction de génotypage iPLEX multiplex sur les échantillons d’ADN en microplaques de 384 puits:

  • réaction de PCR multiplexe – ciblage de régions d’environ 100 nt;
  • traitement SAP («shrimp alkaline phosphatase») – déphosphorylation des dNTP et des amorces PCR non utilisés;
  • réaction iPLEX – réaction d’extension d’une base des différentes amorces de masse multiplexées adjacente à chaque SNP avec un cocktail universel;
  • nettoyage à la résine – élimination des sels contaminants à l’aide d’une résine.

Les produits finaux, une solution d’ADN contenant les produits de la réaction iPLEX, sont transférés de la microplaque de 384 puits vers une micropuce en silicone à l’aide du nanodispenseur MassARRAY. La masse des allèles de chaque SNP est déterminée par spectrométrie de masse sur le MassARRAY Compact MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionozation – Time of Flight), et les résultats sont analysés avec le logiciel MassARRAY TYPER 4.

Préparation des ADN génomiques

  • Purification: les ADN doivent être purifiés avec des trousses de purification commerciale (Sequenom recommande la trousse de purification PUREGENE Genomic DNA de Gentra Systems, qui utilise un Tris 10 mM et 1 mM EDTA pH 7,0-8,0 et donne un très bon rendement par ml de sang).
  • Spectre UV: le ratio d’absorption A260-A280 doit être entre 1,7 et 2,0. Utiliser un stock d’ADN génomique à 50 ng/µl.
  • Concentration: 5 à 10 ng/µl
  • Volume requis: variable selon le nombre de plex. Prière de fournir 20 µl ou plus de chaque échantillon par essai (incluant les possibilités de reprise).

Nombre minimal d’échantillons

Nous demandons plus de 96 échantillons pour ouvrir un projet.

Création d’un fichier de SNP

  • Créez et sauvegardez votre liste de SNP sous Word ou Excel au format texte-tab délimité (*.txt).
  • SNP_ID: donnez un identifiant unique à chaque SNP en utilisant des caractères alphanumériques uniquement (moins de 20 caractères). Évitez les symboles problématiques et les espaces (i-e % $ #). Les tirets, les tirets de soulignement et le point sont les seuls symboles permis, par exemple: tb_3021 ou brca-48889 ou xyz3.1234.
  • Vous devez avoir seulement deux colonnes dans votre fichier: l’une spécifiant le SNP_ID et l’autre la séquence du SNP, celles-ci séparées par une tabulation.
  • La séquence du SNP doit être de moins de 400 nt. L’idéal est d’avoir entre 300 et 400 nt.
  • Exemple d’un fichier de SNP:
SNP_ID SEQUENCE
X-9357 … GCGAGCCTACGTGA[C/T]GTTCTGTCCCA …
X8156 … CTCCAACCTAAAGGCGG[A/T]CCGAGCGATC …
Y_234 … CTTATGCCAAGTGTAGTANN[G/C]ATGACAACATTG …
1.543XY … CCTGACT[C/T]GGTACCGTGTGTTTAG …
  • Les allèles du SNP d’intérêt doivent être identifiés à l’intérieur de crochets avec une barre oblique les séparant (par exemple: [C/T]). À l’intérieur des crochets, utiliser seulement A, C, G et T, ainsi que – pour les insertions ([-/A]) ou les délétions ([T/-]). Les allèles du SNP doivent être notés en majuscules, sans espace. Cependant, vous pouvez mettre en minuscules les portions de séquence à ne pas utiliser. Tous les autres SNP qui ne sont pas à interroger doivent être remplacés par des N, qui ne sont pas traités par le logiciel.