FAQ

Quels sont les protocoles disponibles pour le séquençage?

  1. Standard : convient pour la majorité des plasmides et produits PCR.
  2. GC-riche (ou « dGTP ») : très efficace pour tout ce qui touche les séquences CRISPR, les short hairpins, ou lorsque votre échantillons est riche en GC. Il suffit de le mentionner dans la section « instruction spéciale » du formulaire de commande.
  3. Betaine : l’ajout de betaine et le cyclage de ce protocole aide à défaire les structures secondaires et augmente l’affinité des amorces. Sélectionnez « séquençage avec betaine » dans le menu déroulant du formulaire de commande (notez que le prix par réaction plus élevé).
  4. SH : ce protocole implique de doubler (voire tripler) le volume des réactifs (ADN, amorces, polymérase, tampons de séquençage, etc.). Sélectionnez « séquençage betaine long SH » dans le menu déroulant du formulaire de commande (notez que le prix par réaction plus élevé).

Mon échantillon est-il « GC-riche »?

Il n’y a pas de consensus clair pour la définition d’un échantillon GC-riche. Néanmoins, il faut tenir compte des trois paramètres suivants pour le séquençage :

  • Pourcentage de résidus guanine et cytosine (50% et plus → GC-riche)
  • Stretch de nucléotides (suites de C ou de G dans la séquence)
  • Répétitions (par exemple, une suite de CAG) :
    Si vos échantillons répondent à l’un ou l’autre de ces critères, mentionnez-le dans la section « instruction spéciale » du formulaire de commande.Un outil simple pour calculer le pourcentage de GC d’une séquence se trouve ici : http://www.endmemo.com/bio/gc.php

Dois-je purifier mes produits PCR ?

Si vous obtenez une seule bande sur gel, ne purifiez pas vos produits vous-même.

Nous offrons sans frais supplémentaire la purification de produits PCR sur plaque avec membrane de fibre de verre. Cette méthode de purification est de loin supérieure à n’importe quel kit commercial. Il reste fréquemment des sels ou des traces de solvants organiques dans ces préparations.

La présence de DNA loading buffer n’affecte pas la purification.

Comment préparer mes échantillons pour le transport?

Nous recommandons à nos clients de protéger leurs échantillons dans un tube de plastique de 50 ml (une boîte de tipspeut aussi convenir). Une enveloppe de papier bulle est aussi conseillée…

Si vous utilisez des plaques 96 puits, évitez les plaques de culture cellulaire (non étanches). Les films collants pour plaques de PCR ont tendance à couler et ne sont pas recommandés pour le transport.

Des capuchons de même marque que vos plaques offrent une meilleure alternative.

Comment évaluer la qualité de mes amorces?

Critères de base :

  • Longueur : 18-24 bases, complémentaire à votre matrice d’ADN
  • Pourcentage de GC : environ 50 % (40-60%)
  •  Tm : 50-60°C
  • Optimalement, 1-2 G/C en 5’ et en 3’ (attention ! la séquence en 3’ doit être parfaitement appariée).

L’outil OligoAnalyser, disponible sur le site d’IDT, est utile pour évaluer la qualité des amorces https://www.idtdna.com/calc/analyzer

  • Hairpin : même sur une courte séquence, il est fréquent de voir des structures secondaires se former. Évitez les stretchs de G-C dans vos amorces.
  • Dimères : en gros, si le deltaG ≤ -6.5, une proportion des amorces vont s’auto-apparier et ne seront donc pas disponibles pour la réaction de séquençage (figure a). Si l’appariement est au centre de la séquence (figure b), il faut plutôt considérer qu’un deltaG  ≤ -9 est problématique.

    Figure a.

    Figure b.

Liens utiles

Pour calculer le pourcentage de GC : http://www.endmemo.com/bio/gc.php

Pour évaluer la qualité de vos amorces : https://www.idtdna.com/calc/analyzer (vous aurez besoin d’un login)