Équipement

ABI 3730xl

D’une capacité de production quotidienne de plus d’un million de nucléotides, il est très convoité pour les grands projets de séquençage depuis sa mise en marché en 2002 par la compagnie Applied Biosystems. Nous fûmes les premiers au Canada à en faire l’acquisition cette même année. C’est sur cet appareil que tous les projets de séquençage de notre plateforme sont réalisés.

L’appareil est composé de 96 capillaires, d’un système d’électrophorèse, d’un laser et d’une caméra CCD. Les capillaires, d’un diamètre d’environ 250 µm, sont remplis avec un polymère qui sert de tamis moléculaire. Les molécules d’ADN sont introduites à une extrémité des capillaires par électro-injection et migrent ensuite tout au long de ceux-ci sous l’effet d’un très haut voltage (8 500 volts), de façon à les séparer en fonction de leur longueur. Près de l’anode, un rayon laser traverse chaque capillaire afin d’exciter les molécules fluorescentes qui ont été incorporées à l’ADN durant la réaction de séquence. Une caméra CCD recueille l’information émise par les molécules fluorescentes au fur et à mesure que celles-ci passent devant le rayon laser. Comme chacune des quatre bases nucléiques (A, C, G et T) est associée à un fluorochrome particulier, le système peut les distinguer l’une de l’autre selon la longueur d’onde émise. L’appareil est connecté à un ordinateur qui enregistre les signaux en continu et qui en fera ensuite l’analyse lorsque la migration sera complétée. À la suite du «base calling» relatif à chacun des 96 échantillons, des fichiers de données sont créés.

La méthode de séquençage utilisée est celle de Sanger, qui met à profit l’interruption aléatoire du processus d’élongation de l’ADN au moyen des quatre ddNTP marqués par un fluorochrome.

ABI 3130xl

Le ABI 3130xl est semblable au 3730xl, hormis son nombre réduit de capillaires, soit 16. C’est le premier appareil de cette génération que la compagnie Applied Biosystems a mis sur le marché. Bien que son débit soit beaucoup moins important que le 3730xl, il nous est utile principalement lors du génotypage de marqueurs microsatellites qui peuvent être multiplexés. Cette technique, qui consiste à amplifier des régions polymorphiques à motif répété dans le génome (appelées microsatellites), génère des fragments de longueur variable d’un allèle à l’autre. En marquant l’une des amorces utilisées pour faire le PCR avec un fluorochrome, nous pouvons déterminer ensuite, par électrophorèse capillaire, la longueur exacte de chaque microsatellite étudié chez un individu. Comme l’appareil peut détecter cinq fluorochromes différents et que le même fluorochrome peut être réutilisé plus d’une fois lorsque les fragments ont une différence de plus 100 nucléotides en taille, il nous permet de multiplexer jusqu’à 15 marqueurs par individu dans un même échantillon.

SpectroCHIP

Le SpectroCHIP de Sequenom est une micropuce qui peut supporter jusqu’à 384 échantillons sur ses 384 points de dépôt. Exclusivement développée pour la spectrométrie de masse MALDI_TOF, chaque SpectroCHIP est recouvert de bioxyde de silicium et contient des points de dépôt faits d’une matrice d’acide 3-hydroxypicolinic (3-HPA). Lorsqu’une solution d’ADN purifiée vient en contact avec cette matrice, un cristal d’ADN se forme lors de l’évaporation du solvant. Chaque SpectroCHIP possède dix points de dépôt de calibration, pour supporter un calibrant spécial à trois masses. Ce calibrant sert de standard de masse pour le spectromètre, ainsi que de contrôle positif.

Nanodispenser MassARRAY Samsung

Le Samsung Nanodispenser est un des robots «pintool» de Sequenom. Il comporte une tête de 24 aiguilles capable d’aspirer par capillarité des solutions d’ADN d’une microplaque de 384 puits et de faire la dispense de 15 nl sur chaque point de dépôt du SpectroCHIP. Indépendamment de la tête de 24 aiguilles, une aiguille individuelle est utilisée pour dispenser le calibrant et peut aussi être programmée pour dispenser les échantillons d’une microplaque vers la micropuce. Chaque aiguille est stérilisée dans un sonicateur contenant de l’éthanol avant et après chaque dispense pour éviter la contamination. Une caméra interne agrandit une image de la gouttelette dispensée avant qu’elle cristallise sur la matrice. Avant de procéder au dépôt d’une micropuce expérimentale, l’utilisateur peut faire des essais visuels pour vérifier l’uniformité des dépôts et ajuster la vitesse de dispense afin d’obtenir des résultats optimaux sur le spectre de masse. Généralement, une microplaque de 384 puits peut être déposée sur une micropuce en moins de dix minutes.

Spectre de masse Compact MALDI-TOF

Le spectre de masse Compact MALDI_TOF propose une façon très rapide d’obtenir des génotypes de SNP, de spectre et des mesures de qualité en temps réel. À haut voltage, le laser cible précisément chaque point de dépôt et fait feu sur eux, éjectant les molécules du SpectroCHIP qui volent vers la colonne sous vide du spectre de masse. Comme chaque molécule a une masse propre, chaque allèle d’un SNP peut être déterminé en se basant sur sa vitesse, soit par son temps de vol. Le logiciel RT a la capacité de prendre plusieurs acquisitions et d’utiliser la meilleure pour déterminer le génotype du SNP. Le logiciel RT donne accès à une caméra interne qui permet de voir en temps réel le laser toucher chaque point de dépôt. Après l’acquisition des données, des analyses plus complètes peuvent être faites avec le logiciel TYPER.

Robots JANUS Automated Workstation

Les JANUS Automated Workstations de Perkin Elmer offrent une multitude de technologie de pipettage réunie sur un même instrument. Il s’agit de robots performants, efficaces et polyvalents. Ils ont été conçus afin d’automatiser la préparation et la manipulation des échantillons. Compatibles avec les tubes, les vials, les plaques de 96 puits ou de 384 puits, ils s’adaptent à tout matériel de laboratoire. Nos trois stations JANUS sont équipées d’une tête Varispan de 8 tips et deux stations comportent aussi une tête 96-Modular Dispense Technology™ (MDT). Ces deux bras sont indépendants l’un de l’autre et se déplacent dans les trois directions cartésiennes X-Y-Z. Les volumes pipetés peuvent être aussi bas que 2 uL et peuvent aller jusqu’à 1 mL. Leur versatilité nous permet d’automatiser nos protocoles et nous assure de leur reproductibilité.